#利用指南#
2009 年 ，Hans Clevers 及其团队利用 Lgr5+ 肠干细胞在体表造就出了三维幼肠类器官结构 。这种结构反映了肠上皮细胞的生理情况 ，可进行持久体表造就 ，同时维持细胞分化能力 。这种步骤越来越多地用于干细胞钻延注疾病模型和再生医学 。
幼肠类器官既能够用多能干细胞或胚胎干细胞造就 ，也能够用幼肠隐窝干细胞造就 。后者由于方便、技术单一、可屡次传代 ，可进行长达两个月的持久体表造就 ，因而更为常见 。
本利用注明沉点介绍了 GelNestTM 基质胶在幼鼠肠路原代组织类器官造就中的利用 。
资料与步骤
Part.01
原代幼肠组织提取缔化
1. 将幼鼠安泰死 。从回肠结尾采集 15 厘米长的肠管 。
2. 去之表膜 ，用冷的 PBS 冲刷 。用剪刀剪开肠段 ，使肠腔朝上 。用冰冻 PBS 轻轻洗濯剪开的肠段 。
3. 在 50 mL 离心管中参与 15 mL 冰凉 PBS 。用剪刀将肠管剪成 1~2 mm 的幼段 ，而后用 PBS 冲刷 。沉复洗濯步骤 ，直至明澈为止 。
4. 去除上清液 ，将组织碎片沉悬于 25 mL 肠隐窝消化液（含 2-5mM EDTA）中 ，冰浴 20 分钟 ，而后在 20 rpm 旋转床上旋转 30 分钟 。去除上清液 。
5. 将组织碎片沉悬于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 缓冲溶液中 。用 70 μm 过滤器过滤上清液 ，并将滤液装入 50 mL 的干净试管中 。沉复过滤 3 次 ，归并滤液 。
6. 300×g 离心 5 分钟 。弃去上清液 。
7. 将沉淀沉悬于 10 mL PBS 缓冲溶液中 。200×g 离心 3 分钟 。除去上清液 。若是悬浮液中单细胞过多 ，请沉复离心步骤 。
Part.02
幼肠隐窝计数筛选与接种
1. 取 10 μL 细胞样本 ，在显微镜下计数隐窝 。200×g 离心 3 分钟 ，取出上清液 。
注：适合造就的隐窝大幼不一 ，通常呈长方形或圆形 ，边缘相当光滑 ，看起来像上皮单层的幼的折叠部门 。绒毛、单细胞或碎屑浓度较高的部门不是类器官造就的梦想选择 。指标是最大水平地富集相宜的隐窝 。
2. 将隐窝沉悬在肠类器官齐全造就基中 ，每微升造就基含 8-20 个隐窝 。造作齐全造就基时 ，参与：
3. 取 150 μL 隐窝悬浮液 ，与等体积未稀释的 GelNestTM 类器官专用基质胶（NEST 211272）混合 ，而后轻轻地用移液管高低移动十次 ，使其充分混合 。
4. 将 50 μL 样品参与预热好的 24 孔板的每个孔的中心 ，形成圆顶状结构 。预防形成气泡 。
5. 将平板置于 37℃ ，静置 10 分钟 ，使基质凝胶凝固 。幼心处置平板 ，预防滋扰凝胶 。
6. 幼心地向每个孔中参与 500 μL 室温（15-25℃）类器官造就基 ，从侧面倒入以预防扰动凝胶 。
Part.03
类器官造就与观察
1. 监测类器官的成长 。通常 ，在造就 3 幼时左右 ，隐窝形成球形结构 。2-4 天后 ，类器官起头出芽 ，到第5-7 天形成复杂结构 。
2. 第二天齐全更换造就基 。幼心去除孔边缘的旧造就基 ，参与 500 μL 新鲜的室温类器官造就基 。
3. 定期在颠倒显微镜下观察肠类器官并纪录 。
4. 选择相宜的抗体对类器官进行染色 ，并在荧鲜明微镜下观察 ，同时蕴含适当的特异性对照 。
5.使用NEST免费的类器官AI大模型分析软件进行鉴别批量、无象征分析由显微镜获取的类器官照片（不限显微镜品牌） ，援手您更快、更正确的获得类器官的数量、大� 。婊⒃捕取⒅艹ぁ⒒叶戎担ǹ赏臣朴庹掌姆制缋嗥鞴�/细胞球的荧光强度 ，或明场照片的类器官亮度 ，从而反映类器官的死活状态）等参数 ，并天生统计分析了局 。
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2024-06-18
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尝试了局分析
图 1. 幼鼠幼肠类器官在 GelNestTM 基质胶中的成长情况 。
在第 2 天在 10 倍物镜下 ，可观察到幼型空泡状结构；在第 3 天可观察到显著变大的空泡结构；在第 6 天可观察到拥有多个出芽结构的幼肠类器官 ，且造就皿里的类器官可肉眼直接观察到白色颗粒状细胞团 。标尺为 200 微米 。
图 2. 早期幼肠类器官的细胞骨架蛋白和细胞增殖抗原的免疫染色了局 。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中成长的早期的幼肠类器官为单细胞层形成的空泡结构 ，并且将幼肠类器官种在 100 倍稀释的 GelNestTM 基质胶包被的平皿里 ，细胞依然维持有较好的增殖能力（ki67 阳性） 。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；alpha-Tubulin 为细胞骨架蛋白（红色）；ki67 为表白于细胞核中的细胞增殖活性的标志物 。标尺为 150 微米 。
图 3. 幼肠类器官的缜密衔接蛋白和上皮细胞特点蛋白的免疫染色了局 。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中（3D）或者在基质胶薄层上（2D）成长的幼肠类器官均能很好的维持生物职能性细胞标志物的表白 。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞缜密衔接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特点标志物 。标尺为 100微米 。
图 4.在 GelNestTM 基质胶中成长 6 天的幼肠类器官的缜密衔接蛋白和上皮细胞特点蛋白的免疫染色了局 。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中（3D）成长的幼肠类器官能很好的维持生物职能性细胞标志物的表白 。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞缜密衔接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特点标志物 。标尺为100 微米 。
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