干货 | 皮下成瘤尝试解析
手拿把掐教你使用基质胶！
GelNest?基质胶是由幼鼠肿瘤组织中提取的基底膜成分造备而成，蕴含的重要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。这些成分能够提供细胞黏附、分化和增殖所需的支持和信号，同时也能够模拟生理环境中基底膜的个性，提高细胞造就的成功率和成效。除了基底膜成分，GelNest?基质胶中还富含多种成长因子。这些成长因子能够推进细胞分化、增殖和迁徙，从而进一步模拟生理环境中的细胞信号通路和互动。
GelNest?基质胶拥有宽泛的利用远景，出格是在组织工程、细胞造就和钻研等方面，可被用于类器官造就、干细胞分化、血管天生、迁徙或侵袭和体内肿瘤产生等钻研。
本文针对基质胶在裸鼠皮下成瘤尝试中的利用步骤进行解析。
概述
皮下成瘤尝试通常选用4-8周龄的幼鼠。伦理学通常要求接种肿瘤细胞数量不成超过1×107个/只。成瘤速度凭据细胞的成瘤性、增殖速度、细胞接种量、幼鼠品系等成分有所差距。药物过问周期通常为0.5-2个月。
裸鼠是由于nu基因有怪异的遗传个性，成为科学钻研中拥有巨大潜力的试验模型。经过世界列国尝试动物遗传育种学家的致力，已将nu基因导入分歧近交系动物，成为系列动物模型，仅幼鼠模型一种，已成立了二十余种近交系裸鼠。
常见成瘤细胞
较容易成瘤的细胞：
Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大细胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人玄色素瘤细胞），SGC7901 人胃肿瘤细胞 ，KB人丁腔表皮样癌细胞
能够成瘤但是比力慢的细胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（结肠癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌 ， CT26 （幼鼠结肠癌细胞 ），SH-SY5Y (人神经母细胞瘤细胞 ) ， U251 （人胶质瘤细胞） ， BGC-823（人胃癌细胞） ，PC-3 （人前列腺癌细胞）
一些比力有争议的细胞：
Hela（宫颈癌），HCT（人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞）。
其他：
BMSC（骨髓间充质干细胞）
操作流程
（以Hep-G2细胞为例）
01
将Gelnest?基质胶（高浓度）置于冰中并在4℃过夜消融，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
注：高浓度低因子基质胶的成瘤更快。
02
细胞网络：筹备对数期成长的、细胞密度达80-90%左右的Hep-G2细胞，于网络细胞前一天晚上更换新鲜造就基。胰酶消化细胞，待细胞变圆未脱离造就皿时，去除胰酶，参与无血清造就基造成细胞悬液。网络的细胞悬液300×g离心5分钟，PBS洗涤2次。PBS沉悬细胞至终浓度为8×10^7个细胞/mL。将细胞置于冰上待用。
注：1.悬浮细胞直接管集细胞悬液，贴壁细胞用胰酶消化后网络细胞悬液。
2.网络的细胞宜在1幼时内接种结束。
03
将细胞悬液与基质胶在4℃环境下依照1:1的比例混匀，造备成终浓度为0.5×10^7-5×10^7个细胞/mL。
注：细胞悬液与基质胶混合液需置于冰上以减缓细胞凋亡并预防基质胶凝固。
04
使用尝试动物电动剃毛器对幼鼠注射部位皮肤进行脱毛，而后用酒精棉球进行消毒。
消毒
05
用不带针头的1mL注射器将细胞悬液与基质胶混合液吸入注射器，再装上针头。
注：汲取混合液前可用注射器缓慢奏乐以混匀细胞。
06
左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左侧腋窝处皮下注射，接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，以削减注射后细胞悬液从针眼溢出。接种体积通常为100?L/只。
注：这一过程尽量在半幼时内实现，途中细胞悬液放在冰上以减缓细胞凋亡及预防出现凝胶景象。
排空入针口
接种
接种后观察
07
将裸鼠放回笼内持续豢养，约1-3周可观察到较显著的瘤块，并凭据尝试设计在肿瘤体积不超过1000mm^3前对裸鼠进行安泰死，取出肿瘤，拍照。
肿瘤丈量
肿瘤活体荧光
常见问题与解答
Q1：常见的荷瘤不成功可能的原因？
A：
（1）细胞的状态是成瘤尝试的关键，所以细胞成长状态肯定要好，取处于对数成持久的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜，网络细胞前一天晚上更换新鲜造就基。需参与基质胶辅助或增大接种量或更换细胞系；
（2）可能是幼鼠周龄太大，通常选择5-6周龄裸鼠，幼于4周可能不耐受过早殒命，大于6周免疫力会加强，不易成瘤。
（3）可能是幼鼠免疫倾轧，建议更换免疫缺点水平更大的幼鼠（NSG（蕴含NOG、NCG，B-NDG等）＞Nod-scid幼鼠＞Nude裸鼠）。
（4）接种部位也是成瘤尝试的沉要成分。选择血管丰硕且易操作的部位接种，如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位，其中腋下中后部皮下较好，成瘤率高，比力推荐打腋下，一人操作很方便，后续量瘤子也很好操作。
Q2:肿瘤长起来后又隐没的原因？
A：肿瘤成长过程中，若是出现肿瘤块先缩幼，后变大的景象，很可能是由于炎症反映，肿瘤细胞被幼鼠自身吸收造成的。
持续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，如若后续肿瘤仍旧未长出来，可思考更换免疫缺点水平更大的幼鼠。
Q3：造成肿瘤均一性很差的原因？
A：首先，并不是所有的肿瘤都可能长得均一状态。肿瘤成长不宜过大，通常直径不超过15mm，体积不超过2000mm^3
其次，若是统一分组内幼鼠肿瘤体积差距很大，可能是由于幼鼠的周龄及接种细胞量不一致造成的，建议沉新接种。
Q4：是否能够利用免疫抑造剂加快肿瘤成长？
A：通常不建议加免疫抑造剂，有限思考选择免疫缺点水平更高的幼鼠品系。
一、质量节造介绍
二、选用指南
三、贮存及操作当苦衷项
GelNest?基质胶在分装前能够保留于 -20℃冰箱。初次使用时，应消融后依照单次用量分装，并保留于 -80° C 冰箱，有效期 2 年。把稳不要使用无霜冰箱贮存 GelNest?基质胶。
GelNest?基质胶在 4℃下呈液态，在 37℃时会形成凝胶态，在温度高于 10°C 时就会起头凝固成胶，请预冷移液吸头并尽量在冰上操作。
